Enolase

Fosfopiruvat hidratase, biasanya dikenali sebagai enolase, ialah metaloenzim (EC 4.2.1.11) yang memangkinkan penukaran 2-fosfogliserat (2-PG) kepada fosfoenolpiruvat (PEP), langkah kesembilan dan kedua terakhir bagi glikolisis. Tindak balas kimia ialah:

2-fosfo-D-gliserat $\rightleftharpoons$ fosfoenolpiruvat + H₂O

Phosphopyruvate hydratase tergolong dalam keluarga liase, khususnya hidroliase yang membelah ikatan karbon-oksigen. Nama sistematik enzim ini ialah 2-fosfo-D-gliserat hidroliase (pembentuk fosfoenolpiruvat).

Tindak balas boleh diterbalikkan, dan bergantung kepada kepekatan persekitaran substrat. pH optimum enzim manusia ialah 6.5. Enolase terdapat dalam semua tisu dan organisma yang mampu melaksanakan glikolisis atau penapaian. Enzim ini ditemui oleh Lohmann dan Meyerhof pada tahun 1934, dan sejak itu telah diasingkan daripada pelbagai sumber termasuk otot manusia dan eritrosit. Pada manusia, kekurangan ENO1 dikaitkan dengan anemia hemolisis keturunan, manakala kekurangan ENO3 dikaitkan dengan penyakit penyimpanan glikogen jenis XIII.

Isozim

Pada manusia, terdapat tiga subunit enolase, α, β dan γ, masing-masing dikodkan oleh gen berasingan yang boleh bergabung untuk membentuk lima isoenzim yang berbeza: αα, αβ, αγ, ββ, dan γγ. Tiga daripada isoenzim ini (semua homodimer) lebih kerap ditemui dalam sel manusia dewasa berbanding yang lain:

• αα atau enolase bukan neuron (NNE). Juga dikenali sebagai enolase 1. Ditemui dalam pelbagai tisu, termasuk hati, otak, buah pinggang, limpa dan adiposa. Ia hadir pada tahap tertentu dalam semua sel manusia normal.
• ββ atau enolase khusus otot (MSE). Juga dikenali sebagai enolase 3. Enzim ini sebahagian besarnya terhad kepada otot, di mana ia terdapat dalam tahap yang sangat tinggi dalam.
• γγ atau enolase khusus neuron (NSE). Juga dikenali sebagai enolase 2. Dinyatakan pada tahap yang sangat tinggi dalam neuron dan tisu saraf, di mana ia boleh menyumbang sebanyak 3% daripada jumlah protein larut. Ia dinyatakan pada tahap yang jauh lebih rendah dalam kebanyakan sel mamalia.

Struktur

Enolase ialah ahli superkeluarga enolase yang besar. Ia mempunyai berat molekul 82,000–100,000 dalton, bergantung kepada isoform. Dalam alfa enolase manusia, dua subunit adalah antiselari dalam orientasi, dengan Glu²⁰ daripada satu subunit membentuk ikatan ionik dengan Arg⁴¹⁴ daripada subunit yang lain. Setiap subunit mempunyai dua domain yang berbeza. Domain terminal N yang lebih kecil terdiri daripada tiga heliks α dan empat helaian β. Domain terminal C yang lebih besar bermula dengan dua helaian β, diikuti dengan dua heliks α, dan berakhir dengan balang yang terdiri daripada helaian β berselang-seli dan heliks α yang disusun supaya helaian β dikelilingi oleh heliks α. Struktur globul padat enzim terhasil daripada interaksi hidrofobik yang ketara antara kedua-dua domain ini.

Enolase ialah enzim yang sangat terpelihara, dengan lima sisa tapak aktif yang sangat penting untuk aktiviti. Jika dibandingkan dengan enolase jenis liar, enolase mutan yang berbeza sama ada pada residu Glu¹⁶⁸, Glu²¹¹, Lys³⁴⁵ atau Lys³⁹⁶ mempunyai tahap aktiviti yang dihadkan dengan faktor 105. Satu lagi hal, perubahan yang mempengaruhi His¹⁵⁹ meninggalkan mutan dengan hanya 0.01% daripada aktiviti pemangkinnya. Bahagian penting enolase ialah dua kofaktor Mg²⁺ dalam tapak aktif yang berfungsi untuk menstabilkan cas negatif dalam substrat.

Baru-baru ini, fungsi sampingan beberapa enolase seperti interaksi dengan plasminogen, telah menarik minat terhadap gelung pemangkinan enzim dan kepelbagaian strukturnya.

Mekanisme

Mekanisme penukaran 2PG kepada PEP.

Menggunakan prob isotop, mekanisme keseluruhan untuk menukar 2-PG kepada PEP dicadangkan sebagai tindak balas penyingkiran E1cB yang melibatkan perantaraan karbanion. Mekanisme terperinci berikut adalah berdasarkan kajian struktur kristal dan kinetik. Apabila substrat, 2-fosfogliserat, mengikat α-enolase, kumpulan karboksilnya menyelaras dengan dua kofaktor ion magnesium dalam tapak aktif. Ini menstabilkan cas negatif pada oksigen ternyahproton sambil meningkatkan keasidan hidrogen alfa. Lys³⁴⁵ Enolase menyahprotonasi hidrogen alfa, dan cas negatif yang terhasil distabilkan oleh resonans kepada oksigen karboksilat dan oleh kofaktor ion magnesium. Berikutan penciptaan perantaraan karbanion, hidroksida pada C3 disingkirkan sebagai air dengan bantuan Glu²¹¹, dan PEP terbentuk.

Selain itu, perubahan konformasi berlaku dalam enzim yang membantu pemangkinan. Dalam α-enolase manusia, substrat diputar ke dalam kedudukan apabila mengikat enzim disebabkan oleh interaksi dengan dua ion magnesium pemangkin, Gln¹⁶⁷ dan Lys³⁹⁶. Pergerakan gelung Ser³⁶ ke His⁴³, Ser¹⁵⁸ ke Gly¹⁶², dan Asp²⁵⁵ ke Asn²⁵⁶ membolehkan Ser³⁹ menyelaras dengan Mg²⁺ lalu menutup tapak aktif. Sebagai tambahan kepada penyelarasan dengan ion magnesium pemangkin, pKa hidrogen alfa substrat juga diturunkan disebabkan oleh protonasi kumpulan fosforil oleh His¹⁵⁹ dan kedekatannya dengan Arg³⁷⁴. Arg³⁷⁴ juga menyebabkan Lys³⁴⁵ dalam tapak aktif ternyahproton, yang menetapkan Lys³⁴⁵ dalam peranannya dalam mekanisme.

Kegunaan diagnosis

Dalam eksperimen perubatan baru-baru ini, kepekatan enolase telah diambil sampel dalam percubaan untuk mendiagnosis keadaan tertentu dan keterukan mereka. Contohnya, kepekatan enolase yang lebih tinggi dalam cecair serebrospinal lebih kuat berkorelasi dengan astrositoma gred rendah berbanding enzim lain yang diuji (aldolase, piruvat kinase, kreatina kinase dan laktat dehidrogenase). Kajian yang sama menunjukkan bahawa kadar pertumbuhan tumor terpantas berlaku pada pesakit dengan tahap enolase CSF tertinggi. Peningkatan tahap enolase juga telah dikenal pasti pada pesakit yang telah mengalami infarksi miokardium atau kemalangan serebrovaskular baru-baru ini. Ada kesimpulan bahawa tahap enolase khusus neuron CSF, serum NSE, dan kreatina kinase (jenis BB) boleh menjadi petunjuk dalam penilaian prognosis mangsa serangan jantung. Kajian lain telah memberi tumpuan kepada nilai prognostik nilai NSE dalam mangsa kemalangan serebrovaskular.

Autoantibodi kepada alfa-enolase dikaitkan dengan artritis reumatoid dan sindrom jarang jumpa, ensefalopati Hashimoto.

Perencat

Perencat molekul kecil enolase telah disintesis sebagai probe kimia (substrat-analog) mekanisme pemangkin enzim dan baru-baru ini, telah disiasat sebagai rawatan berpotensi dalam kanser dan penyakit berjangkit. Kebanyakan perencat mempunyai sifat pengkelat logam dan mengikat enzim melalui interaksi dengan atom magnesium struktur, Mg(A). Sebatian yang paling mujarab ialah fosfonoasetohidroksamat yang memiliki mempunyai pertalian pM untuk enzim dalam bentuk tidak terprotonasi. Ia mempunyai persamaan struktur dengan perantara pemangkin yang dianggap, antara PEP dan 2-PG. Percubaan telah dibuat untuk menggunakan perencat ini sebagai ubat antitripanosom, dan lebih baru-baru ini, sebagai agen antikanser, khususnya, dalam glioblastoma kekurangan enolase disebabkan oleh penghapusan homozigot gen ENO1 sebagai sebahagian daripada lokus penindas tumor 1p36 (kematian sintetik). Antibiotik fosfonat produk semula jadi, SF2312 (CAS 107729-45-3) yang aktif terhadap bakteria positif dan negatif Gram, terutamanya dalam keadaan anaerob, ialah perencat potensi tinggi enolase 4zcw yang mengikat dengan cara yang serupa dengan fosfonoasetohidroksamat, 4za0. SF2312 menghalang aktiviti enolase dalam kedua-dua asal eukariot dan prokariot, mencerminkan pemuliharaan evolusi enolase yang kuat dan asal purba laluan glikolisis. SF2312 ialah molekul kiral dengan hanya 3S-enantiomer yang menunjukkan aktiviti perencatan enolase dan aktiviti biologi terhadap bakteria. Baru-baru ini, terbitan SF2312 yang dipanggil HEX, dan prodrugnya, POMHEX, ditunjukkan menggunakan aktiviti antineoplastik terhadap glioma yang dipadamkan ENO1 dalam model tetikus ortotopik intrakranium praklinikal. Pengikat alosterik, ENOblock, pada mulanya digambarkan sebagai perencat enolase, tetapi kemudiannya ditunjukkan tidak sebenarnya menghalang enzim, sebaliknya, mengganggu ujian enzim enolase in vitro. ENOblock didapati mengubah penyetempatan sel enolase, mempengaruhi fungsi sekunder bukan glikolisis seperti peraturan transkripsi. Analisis seterusnya menggunakan ujian komersial juga menunjukkan bahawa ENOblock boleh menghalang aktiviti enolase dalam konteks biologi, seperti sel dan tisu haiwan. Metilglioksal juga telah digambarkan sebagai perencat enolase manusia.

Perencat enolase analog keadaan peralihan tapak aktif telah diterokai secara praklinikal untuk rawatan pelbagai patogen mikrob, serta dalam onkologi ketepatan untuk tumor dengan penghapusan homozigot 1p36 yang kekurangan ENO1.